Extracção de DNA

Nas células eucarióticas, além do DNA nuclear, é possível encontrar ainda DNA no interior das mitocôndrias e dos cloroplastos, designando-se respectivamente por DNA mitocondrial e DNA plastidial. Estas moléculas, apesar de se encontrarem no interior de células eucarióticas, são em tudo semelhantes ao DNA dos procariontes.

Extracção do DNA - Esquema geral

Na aula foi utilizado como material biológico: pêras, maçãs e tomate.

O conhecimento cada vez mais profundo da estrutura do DNA e do funcionamento da molécula de DNA tem permitido ao Homem perceber que o pode manipular e utilizar na resolução de inúmeros problemas da vida quotidiana.

As moléculas de DNA são únicas na sua composição geral e na estrutura. Nas várias células somáticas de um mesmo indivíduo elas são, em condições normais, exactamente iguais. Em diferentes indivíduos, o DNA pode variar no número de nucleótidos, na percentagem relativa das quatro bases e na sequência com que estas se apresentam.

O que se fez para ajudar a quebrar mecanicamente as membranas das células?

Que substância, contendo enzimas, foi adicionada para ajudar à destruição da bicamada fosfolipídica das membranas celulares?

Qual a substância em que o DNA é insolúvel e que, por isso, provoca a precipitação e visualização?

Que aspecto apresenta o DNA extraído?

Nesta actividade, o DNA foi separado grosseiramente de outros constituintes celulares.

Um pouco mais a sério...

Descoberta de um novo código genético

O pré-RNAm, ao ser sintetizado, transcreveu a cadeia de DNA, incluindo os seus segmentos codificáveis e os não codificáveis. Por este motivo, o pré-RNAm é constituído por sequências codificáveis (exões) e por sequências não codificáveis (intrões).

Para que não haja interrupção na sequência de aminoácidos codificados, o RNAm tem de ter, na sua totalidade, significado genético. Por esta razão, ocorre o processamento ou maturação do pré-RNAm. Deste modo, enzimas específicas retiram as sequências não codificáveis de pré-RNAm (intrões), deixando apenas as sequências codificáveis (exões). Forma-se assim uma cadeia de RNAm totalmente codificável, ou seja, uma cadeia de RNAm em que cada codão codifica um aminoácido. A totalidade do pro­cesso ocorre no núcleo.

Esta visão simplista da maturação do RNA mensageiro foi agora alterada com os trabalhos publicados por dois investigadores da Universidade de Toronto, Canadá.

Dois investigadores da Universidade de Toronto descobriram uma visão radicalmente nova de como as células vivas usam um número limitado de genes para gerar órgãos enormes e complexos como o cérebro.

A equipa de investigação liderada pelos professores Brendan Frey e Benjamin Blencowe descreveu um código oculto no DNA, que explica um dos mistérios centrais da pesquisa genética: como um número limitado de genes humanos pode produzir um número muito maior de mensagens genéticas.

Quando o genoma humano foi completamente sequenciado em 2004, cerca de 20 mil genes foram encontrados. No entanto, descobriu-se que as células vivas usam esses genes para gerar uma fonte muito mais rica e dinâmica de instruções, composta por centenas de milhares de mensagens genética que dirigem as actividades celulares.

Para descobrir como as células vivas produzem essa diversidade nas suas informações genéticas, Frey e seu colega Yoseph Barash desenvolveram um novo método de análise biológica assistida por computador que encontra palavras-código escondidas dentro do genoma que constituem o que é referido como um "código de união". Este código contém as regras biológicas que são utilizadas para governar, como partes separadas de uma mensagem genética copiada de um gene, podem ser emendadas juntas, de diferentes maneiras, para produzir mensagens genéticas distintas (RNA mensageiro).

O “Enigma machine” é um programa informático que consegue descodificar as mensagens dos nossos genes.

"Por exemplo, três genes neurexin podem gerar mais de três mil mensagens genéticas que ajudam a controlar o metabolismo do cérebro", exemplificou Frey.

"Anteriormente, os investigadores não poderiam prever como essas mensagens seriam reorganizadas, ou emendadas, numa célula viva. O código de união que nós descobrimos foi usado, com sucesso, para prever como milhares de informações são reorganizadas de forma diferente em vários tecidos diferentes", acrescentou Frey.

A explicação para este processo interessante de "decifração do código de splicing" pode ser encontrado na revista Science et Vie do mês de Outubro.

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Biossíntese de Proteínas

TRANSCRIÇÃO

A transcrição é um processo que decorre de modo semelhante à replicação, baseando-se numa rigorosa complementaridade entre bases e interacções específicas entre proteínas e DNA. No entanto, abrange apenas pequenas extensões do genoma e ocorre sempre que a célula o necessite.

A síntese do RNA é ca­talisada na direcção 5' —> 3' pelas RNA polimerases que utilizam como substrato os trifosfatos 5' de ribonucleósidos (ATP, GTP, CTP e UTP). Embora num genoma sejam utilizadas as duas cadeias do DNA como molde, para cada gene é usada apenas uma e sempre a mesma cadeia.

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Por convenção, num gene é sempre apresentada a cadeia codi­ficante do DNA, isto é, a cadeia que não serve de molde e que corre de 5' —» 3' no mesmo sentido que o RNA. Por isso se chama extre­midade 5' e extremidade 3' de um gene à pri­meira e última parte transcritas, respectivamente.

CÓDIGO GENÉTICO E A TRA­DUÇÃO

Há 61 codões, que codificam os 20 aminoácidos e três codões (codões de terminação ou codões stop), que não codificam nenhum aminoácido. Diz-se que o código é degenerado, por haver mais de um codão para cada aminoácido (com excepção da metionina e triptofano).

Os três codões de terminação são UAA, UAG e UGA e o codão de iniciação é AUG, que codifica a metionina. Apesar de haver preferência pelo uso de certos codões nos diversos organismos, o código genético é considerado universal, salvo algumas excepções como é o caso da mitocôndria.

Segundo o rigoroso emparelhamento de watson e crick, deveria haver exactamente 61 anticodões para os 61 codões, mas há mais codões que anticodões.

Tal facto é explicado pela capacidade de um anticodão poder re­conhecer mais do que um codão. 

As mu­tações que ocorram na terceira base de um codão da sequência codificante de um gene não originam normalmente alterações apre­ciáveis; mutações na primeira ou segunda base podem ter, segundo o código genético, dife­rentes consequências a nível da função da respectiva proteína, e são definidas da seguinte maneira.

Fonte : Engenharia Genética - Lidel

Bg 10 síntese proteica

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Semiconservativa, bidireccional e semidescontínua

O DNA constitui a base química da hereditariedade, armazenando vastas quantidades de informação que são o elo de ligação genético entre gerações.

Como tal, por um lado o DNA tem de ser correctamente copiado e, por outro lado, deve também ser mantido e reparado durante o período de vida de uma célula.

O processo de replicação do DNA, isto é, a duplicação do DNA com obtenção de moléculas de DNA idênticas a uma molécula de DNA original, não deixou de levantar questões de ordem estrutural e bioquímica.

A replicação do DNA apresenta como características ser:

• Semiconservativa
• Bidireccional
• Semidescontínua

Estas características estão presentes quer em procariotas, quer em eucariotas.

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O maravilhoso mundo do RNA

Grande parte dos processos biológicos que decorrem nos organismos não podem ser totalmente compreendidos se não tivermos um conhecimento detalhado do RNA.

O RNA está cheio de surpresas. De facto, os vários tipos de RNA constituem uma classe altamente complexa de moléculas com uma vasta variedade de papéis ao nível celular. Em 2006, dois prémios Nobel foram atribuídos a investigações no campo do RNA. O Nobel da Química foi concedido a Kornberg no estudo de factores de transcrição do RNA e o Nobel da Medicina e Fisiologia foi concedido a Fire e Mello na descoberta do RNA de interferência .

O "Dogma Central da Biologia" apresentado nos anos 50 postula que a transmissão da informação genética ocorre no sentido DNA-RNA-Proteína. Desde então, numerosos estudos mostraram que o papel do RNA não se resume apenas a esta função intermediária, e que diversas moléculas de RNA têm uma função de primeira linha em vias fundamentais de regulação génica.

Segundo a visão tradicional, a população de moléculas de RNA de uma célula divide-se em três categorias principais com funções celulares distintas:

• RNA mensageiro (mRNA),
• RNA ribossomal (rRNA) e
• RNA de transferência (tRNA).

Contudo, nos últimos anos foram identificados milhares de RNAs que exercem uma função específica na célula sem nunca darem origem a proteína.

A RNómica, ou seja, o estudo dos RNAs funcionais e das suas interacções ao nível do genoma, é um campo de extrema importância na ciência actual, em particular na chamada "era pós-genómica". Estes transcritos podem regular activamente a expressão génica estando envolvidos em várias funções celulares como a replicação do RNA, trancrição, splicing, processamento e degradação do RNA, tradução e até controlo de qualidade e translocação das proteínas. MicroRNAs (miRNAs) e pequenos RNAs de interferência (siRNAs) ligam-se aos seus mRNAs complementares e guiam o silenciamento de genes. Tem sido sugerido que muitos destes RNAs não codificantes representam os vestígios do mundo primitivo onde o RNA desempenhava todas as funções - "O Mundo do RNA".

Os pequenos RNAs sintetizados quimicamente são uma poderosa e inovadora ferramenta para a análise da função dos genes e para a terapia génica.

Excerto da introdução do livro "O Mundo do RNA - Cecília Arraiano e Arsénio Fialho. Lidel

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Modelo da molécula de DNA - Aula Prática

Bgpt 1 modelos de dna

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A mais bela experiência em Biologia

A hipótese de Watson e Crick de que a du­plicação do DNA é semiconservativa foi compro­vada numa experiência clássica, realizada em 1958 pelos investigadores norte-americanos Matthew Stanley Meselson e Franklin William Stahl. Nessa experiência utili­zou-se uma técnica de centrifugação então recém-descoberta, que permite separar moléculas com densidades ligeiramente diferentes entre si.

Meselson e Stahl partiram do pressuposto de que moléculas de DNA contendo proporções dife­rentes de isótopos do elemento Azoto/nitrogénio, pesa­do (¹⁵N) e leve (¹⁴N), poderiam ser separadas por meio da técnica de centrifugação conhecida como centrifugação em gradiente de cloreto de césio. Os investigadores deixaram que bactérias da espécie Escherichia coli se multiplicassem num meio de cultura em que todos os átomos dis­poníveis de azoto, na forma de sais de amónia, eram do isótopo ¹⁵N.

Após 14 gerações vi­vendo nesse meio, praticamente todo o DNA das bactérias continha apenas o isótopo ¹⁵N, uma vez que as bactérias utilizam as substâncias do meio para produzir os componentes de suas células, in­clusive as bases azotadas do seu DNA.

Uma parte das bactérias foi separada e teve seu DNA extraído para análise. As bactérias res­tantes foram transferidas para um novo meio de cultura em que a fonte de azoto continha ape­nas átomos do isótopo leve (¹⁴N) desse elemento químico. Assim, todas as substâncias azotadas produzidas pelas células a partir desse momento, entre elas o DNA, passaram a conter átomos des­se isótopo.

Após as bactérias terem se duplicado uma pri­meira vez, no meio com ¹⁴N, Meselson e Stahl reti­raram parte delas para a análise do DNA. As bacté­rias restantes multiplicaram-se novamente no meio com ¹⁴N e uma nova amostra foi retirada. Esse pro­cedimento foi repetido, originando uma terceira amostra de bactérias.

As diversas amostras de DNA foram subme­tidas a centrifugação e as densidades das molécu­las presentes em cada uma delas foram determi­nadas com base na posição em que o DNA ficou estacionado no tubo de centrifugação. Nesse tipo de centrifugação, a posição em que as moléculas estacionam na solução de cloreto de césio, após a centrifugação, tem relação com sua densidade: moléculas menos densas, no caso com maior quan­tidade de ¹⁴N (isótopo leve), ficam mais próximas à superfície da solução, enquanto moléculas mais densas, no caso com maior quantidade de ¹⁵N (isótopo pesado), ficam mais próximas do fundo do tubo de centrifugação.

As moléculas de DNA extraídas de bacté­rias cultivadas durante muitas gerações em meio com isótopo de azoto pesado (¹⁵N) estacio­naram todas próximas ao fundo do tubo. Após uma geração crescendo em meio com isótopo de azoto leve (¹⁴N), todas as moléculas estacio­naram na região mediana do tubo, ou seja, eram menos densas que as que continham apenas ¹⁵N. Após duas gerações em meio com ¹⁴N, metade das moléculas estacionou na região mediana do tubo e metade estacionou na região superficial do tubo, na posição que seria esperada para moléculas con­tendo apenas ¹⁴N. Após três gerações em meio com ¹⁴N, 25% das moléculas estacionaram na região me­diana do tubo, enquanto as 75% restantes estacio­naram na região superficial do tubo.

Esse resultado corresponde exactamente ao es­perado para a hipótese de a duplicação do DNA ser semiconservativa.

 As experiências sub­sequentes confirmaram que a duplicação do DNA é um processo semiconservativo.

Fonte : Biologia das Células 1 - Amabis e Martho. Moderna

Bg 7 replicação do dna

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